背景技术：

女性下生殖道共生着许多微生物菌群，对病原体的侵入有自然防御功能，但是当阴道的微生态失调、自然防御功能遭到破坏，病原体则易侵入，导致阴道炎、宫颈炎、盆腔炎等疾病的发生，增加了艾滋病和宫颈癌的风险；患有阴道炎的女性在怀孕时会影响精子的质量，甚至导致不孕；即使怀孕孕期也很容易引起宫内感染、产道感染等环节感染胎儿、新生儿，造成流产、早产、先天发育畸形、智力低下等严重后果。

阴道微生物增殖感染引发的感染类型主要有细菌性阴道病、外阴阴道假丝酵母菌病、滴虫性阴道炎、需氧菌性阴道炎以及细胞溶解性阴道病等。细菌性阴道病是一种由阴道加德纳菌和一些厌氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，其中线索细胞阳性是细菌性阴道病诊断的一个重要指标。外阴阴道假丝酵母菌病是假丝酵母菌在一定条件下感染女性下生殖道引起的一种阴道炎症，其中80％-90％的外阴阴道假丝酵母菌病是由白假丝酵母菌增殖感染引起，所以观察阴道分泌物样本中真菌孢子、芽生孢子以及假菌丝是重要的镜检指标。滴虫性阴道炎主要是由阴道毛滴虫感染引起，是一种常见的性传播疾病。阴道毛滴虫呈梨形，长为10-30μm，适宜在25-40℃、ph5.5-6.6的潮湿环境下生长。镜检中阴道毛滴虫阳性是滴虫性阴道炎感染的诊断标准，临床样本送检过程中需要注意保温。

国内医院常用的阴道分泌物检验方法为生理盐水湿片镜检，直接检查清洁度及有无滴虫和真菌菌丝。该方法操作简单方便，成本低但主观性强。该方法对于样本中的细胞以及微生物均没有染色效果，根据各成分的形态来辨别，但是由于整个涂片背景较复杂，有时候较难观察识别一些微小的微生物，如真菌类感染。而且对于滴虫感染，如果样本在送检过程中样本保存不当，如温度过低会导致滴虫死亡或活性较低，则在镜下不容易被观察到，容易造成漏诊。

革兰氏染色也是目前部分医院采用的镜检染色方法之一，该方法可以清晰观察到样本中的微生物情况，如微生物的革兰氏阳性或阴性，但是该方法操作复杂，一般需进行4步染色方法，且染色过程中对于染色的技术要求较高，如脱色过程若过度脱色，则会造成结果的不准确，所以对医技人员要求较高。而且由于滴虫的形态和尺寸与白细胞、细胞核非常相近，因此极易造成对于滴虫检测的干扰。

目前市面上出现一种对于阴道分泌物样本中的真菌、厌氧菌和毛滴虫的荧光染色产品，但该方法制片和染色复杂，需要在玻片上进行两次涂片以及两次染色，而且观察过程中还需要切换不同的显微镜光源，操作中比较繁琐。

传统的微生物染色技术，直接湿片镜检镜下干扰物质较多，对于少量假丝酵母菌的孢子及滴虫很难观察；革兰氏检测对于滴虫检测灵敏度较差，极易造成漏检。免疫荧光技术也逐渐应用到阴道微生物检测中，但是该检测方法检测目标单一，对于未知样本需要同时进行多次检查，而且该检测方法操作步骤繁琐，耗时较长。干化学酶法同样对于病原菌较少感染的样本灵敏度较差，不利于早期发现，而且对于样本中常见的血性标本、精液标本和基底层细胞标本等污染标本检测准确性较低，容易误诊。pcr检测方法灵敏度高，但是操作流程复杂、费时，且需要昂贵的仪器和试剂。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种快速检测阴道微生物的双重荧光染色液及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种阴道微生物检测双重荧光染色液，所述的阴道微生物检测双重荧光染色液包括独立的双重荧光染色液a液和双重荧光染色液b液；所述的双重荧光染色液a液由荧光染色剂、辅助染色剂、染色液缓冲试剂、抑菌剂和水组成，双重荧光染色液b液由染色液缓冲试剂、碱性调节试剂、抗淬灭剂、抑菌剂和水组成。

进一步地，所述的双重荧光染色液a液中荧光染色剂为生物荧光染料，

所述的双重荧光染色液a液中荧光染色剂由主要组成成分和辅助染色剂组成，所述的主要组成成分为异硫氰酸荧光素fitc、sybrgreeni、sybrgreenⅱ、lightgreen、evergreen、碘化丙啶pi、吡啰红g、藻红素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物percp或溴化乙啶中的一种或几种的组合；辅助染色剂为果绿、甲基绿或亮绿中的一种或几种的组合。

进一步地，所述的双重荧光染色液a液中荧光染色剂为sybrgreeni染色剂和percp染色剂，所述的sybrgreeni染色剂中的染料的体积比的范围为0.05-5000μl/l；所述的percp染色剂质量浓度范围为0.1-5000μg/l；

所述的辅助染色剂为甲基绿染色剂，所述的甲基绿染色剂的染料的质量浓度范围为1-100mg/l。

更进一步地，所述的染色液缓冲试剂为乙酸-乙酸钠缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或tris-hcl缓冲体系中的一种或几种的组合；

双重荧光染色液a液为乙酸-乙酸钠缓冲体系，乙酸和乙酸钠的质量浓度分别为0.01-100g/l和0.1-100g/l。

进一步地，所述的双重荧光染色液b液中的染色液缓冲试剂为磷酸盐缓冲体系，所述的染色液缓冲试剂为无水磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，所述的无水磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠的质量浓度分别为0.1-50g/l和0.1-200g/l。

进一步地，所述的双重荧光染色液b液中碱性调节试剂为无机碱，所述的无机碱为氢氧化钾或氢氧化钠，所述的无机碱的质量浓度为1-500mg/l；

所述的抗淬灭剂为1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷、n-丙基没食子酸盐、甘油、对苯二胺或抗坏血酸中的一种或几种的组合；

所述的抑菌剂为硫柳汞、叠氮钠、proclin300或庆大霉素中的一种或几种的组合。

更进一步地，所述的抗淬灭剂为甘油，抗淬灭剂的质量浓度为0.5-50g/l；所述的抑菌剂为proclin300，抑菌剂的质量浓度为0.01-10g/l。